وبلاگ در باره پی سی آر در زمان واقعی همچنان استاندارد طلا برای تجزیه و تحلیل بیان ژن است

اگر PCR معمولی به عنوان "گلاس بزرگ کننده" زیست شناسی مولکولی عمل کند، پس PCR کمی در زمان واقعی (qPCR) به عنوان یک میکروسکوپ دقیق عمل می کند.اين تکنولوژی پیشرفته نه تنها توالی ژن هدف را تقویت می کند بلکه روند تقویت را در زمان واقعی دنبال می کند، که امکان کمیابی دقیق سطح بیان ژن را فراهم می کند.انتقال از برآوردهای تقریباً PCR به دقت و کارایی PCR در زمان واقعی نشان دهنده یک تکامل اجتناب ناپذیر در تحقیقات زیست شناسی مولکولی مدرن است..

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) ، یک تکنیک انقلابی در زیست شناسی مولکولی است که از پرایمرهای اولیگونوکلوئوتید خاص توالی، پلیمراز دی ان ای مقاوم به گرما،و چرخه حرارتی دقیق برای تکثیر نمایی توالی های خاص DNA یا cDNA، به دست آوردن تقویت میلیون برابر. Traditional endpoint PCR requires post-reaction detection and quantification through gel electrophoresis and image analysis—a time-consuming process with limited precision that struggles to meet growing demands for quantitative analysis.

qPCR در زمان واقعی این چشم انداز را با نظارت بر تولید محصول در طول هر چرخه PCR تغییر داده است.محققان می توانند مقادیر اولیه توالی هدف را با دقت استثنایی تعیین کنند.در حالی که PCR به طور نظری مولکول های هدف را در هر چرخه دو برابر می کند، تلاش های اولیه برای کمی کردن مواد اولیه از طریق شمارش چرخه و اندازه گیری محصولات پایان ناپذیر ثابت شد.qPCR در زمان واقعی برای پاسخگویی به نیازهای کمیابی قوی ظهور کرد، در حالی که PCR نقطه پایان در درجه اول برای تقویت قطعات خاص DNA برای توالی، شبیه سازی و سایر کاربردهای زیست شناسی مولکولی مفید است.

این فناوری محتوای DNA را پس از هر چرخه با استفاده از رنگ های فلورسنت که به محصولات PCR (amplicons) متصل می شوند، اندازه گیری می کند. شدت فلورسنت مستقیماً با مقدار آمپلیکون ارتباط دارد.امکان کمی کردن مقادیر قالب اولیه از طریق نظارت بر تغییرات سیگنالگزارشگرهای فلورسنت رایج عبارتند از:

• رنگ های پیوند دهنده DNA دو رشته ای (dsDNA)
• مولکول های رنگ آمیزی متصل به پرایمرهای PCR یا سُند های هیبرید سازی

ابزارهای تخصصی ترکیب چرخه حرارتی با اسکن فلورسنت برای تولید منحنی های تقویت (شکل 1) که شدت فلورسنت را بر اساس تعداد چرخه نشان می دهد، ترکیب می کنند.نشان دهنده تجمع محصول در طول فرآیند PCR.

• نظارت در زمان واقعی بر پیشرفت PCR
• مقدار دقیق آمپلیکون در هر چرخه
• محدوده تشخیص پویا گسترده تر
• سیستم لوله بسته، دستکاری پس از PCR را از بین می برد.

این فناوری به استاندارد طلا برای تشخیص و کمی کردن DNA / RNA تبدیل شده است و به دقت دو برابر با محدوده های پویا که از 6 تا 8 درجه بزرگ می باشد، دست یافته است.

یک پروتکل استاندارد PCR در زمان واقعی 40 چرخه را اجرا می کند که هر کدام شامل:

تزریق در دمای بالا (معمولاً 95 درجه سانتیگراد) DNA دو رشته ای را به رشته های تک ذوب می کند در حالی که ساختارهای ثانویه را مختل می کند. قالب های غنی از GC ممکن است به زمان های طولانی تر دناتوراسیون نیاز داشته باشند.

توالی های مکمل در دمای 5°C زیر دمای ذوب شدن پرایمر (Tm) همجنس می شوند.

پلیمراز DNA در ۷۰ تا ۷۲ درجه سانتیگراد به طور بهینه عمل می کند و پرایمر را با سرعت تا ۱۰۰ پایه در ثانیه گسترش می دهد. برای آمپلیکان های کوچک، این مرحله اغلب با گرم کردن در ۶۰ درجه سانتیگراد ترکیب می شود.

این رویکرد ابتدا RNA را به cDNA با استفاده از ترانسکرتاز معکوس (RT) با پرایمرهای تصادفی، اولیگو ((dT) ، یا ژن خاص، ترجمه می کند.سپس حدود ۱۰ درصد از cDNA به لوله های جداگانه برای PCR در زمان واقعی منتقل می شود.مزایا شامل:

• بهینه سازی مستقل مراحل RT و PCR
• توانایی تجزیه و تحلیل چندین ژن از یک cDNA واحد
• حساسیت بالاتر برای نسخه های کم افزایشی

ترکیب سنتز cDNA و PCR در یک لوله واحد خطر آلودگی و اشتباهات دستکاری را کاهش می دهد. این روش نیاز به پرایمرهای ژن خاص برای جلوگیری از محصولات غیر خاص دارد.که آن را برای برنامه های کاربردی با سرعت بالا ایده آل می کند.

PCR در زمان واقعی در موارد زیر عملکردهای حیاتی را انجام می دهد:

• تجزیه و تحلیل بیان ژن:مقایسه سطح ترانسکرپتی در بافت ها، سلول ها یا شرایط آزمایشی
• تشخیص عوامل بیماری زا:شناسایی سریع عفونت های ویروسی، باکتریایی و قارچی
• توسعه داروها:غربالگری ترکیبات و ارزیابی اثرات دارویی
• تشخیص بالینی:تشخیص علائم سرطان، اختلالات ژنتیکی و بیماری های عفونی

فناوری های نوظهور مانند PCR دیجیتال و تجزیه و تحلیل ذوب شدن با وضوح بالا وعده می دهند که برنامه های PCR در زمان واقعی را گسترش دهند. ابزارهای نسل بعدی حساسیت ، سرعت ،و قابلیت های تجزیه و تحلیل داده ها، در حالی که گزارشگرهای فلورسنت جدید نسبت سیگنال به سر و صدا را بهبود می بخشند. کاربردهای آینده ممکن است شامل پزشکی شخصی، نظارت بر محیط زیست،و آزمایش ایمنی مواد غذایی ◄ قرار دادن PCR در زمان واقعی به عنوان یک ابزار ضروری برای پیشرفت علمی و بهداشت عمومی.