PCR در مقابل Qpcr تفاوت های کلیدی در اصول و کاربردهای

تکنولوژی تقویت ژن، که اغلب به عنوان "فوتوکپی" میدان زیست شناسی توصیف می شود، نقش محوری در تشخیص بیماری، تحقیقات ژنتیکی و سایر حوزه های علمی دارد.در میان این فناوری ها، PCR و qPCR در نگاه اول شبیه به هم به نظر می رسند اما اهداف متفاوتی را انجام می دهند. این مقاله تفاوت های اساسی، کاربردهای آنها را بررسی می کند.و به ویژه روش های تجزیه و تحلیل داده های آنها برای کمک به محققان در تصمیم گیری آگاهانه.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک در آزمایشگاه برای تقویت قطعات خاص DNA است. با استفاده از پلیمراز DNA،PCR از چرخه های گرم و خنک کننده مکرر برای افزایش نمایی توالی های DNA هدف استفاده می کندهسته ی این تکنولوژی در طراحی پرایمر (پایمر) قرار دارد. دنباله های کوتاه مکمل انتهای DNA هدف هستند که DNA پولیمراز را برای تکثیر مناطق خاص هدایت می کنند.

1. دناتوراسیون:گرم کردن نمونه DNA (94-98°C) DNA دو رشته ای را به رشته های تک جدا می کند.
2. از آب گرم کردن:کاهش دما (50-65 °C) اجازه می دهد که پرایمرها به دنباله های هدف متصل شوند.
3. تمدید:در دمای مطلوب پلیمراز (72 درجه سانتیگراد) ، رشته های جدید DNA از پرایمر ها سنتز می شوند.

تکرار این چرخه ها به سرعت میلیون ها کپی DNA را تولید می کند. محصولات PCR معمولاً از طریق الکتروفورز ژل آگاروز تجزیه می شوند که قطعات را بر اساس اندازه جدا می کند.

• کلون کردن ژن:تقویت ژن های خاص برای ساخت DNA ترکیب مجدد
• توالی DNA:ارائه نمونه DNA کافی
• تشخیص بیماری:تشخیص عوامل بیماری زا یا جهش های ژنتیکی
• پزشکي:اثر انگشت دي ان اي

PCR کمی (qPCR) یا PCR در زمان واقعی، یک نسخه پیشرفته است که تقویت DNA را در زمان واقعی نظارت می کند و امکان کمیابی دقیق را فراهم می کند.این تکنولوژی از نشانگرهای فلورسنت استفاده می کند که با غلظت DNA ارتباط دارند.

• رنگ های فلورسنت:SYBR سبز DNA دو رشته ای را متصل می کند، و فلورسنت در طول تقویت افزایش می یابد. مقرون به صرفه اما کمتر خاص است.
• لوله های فلورسنت:سُند هاي سري خاص فقط وقتي به هدف متصل ميشن فلوروسانس تشعشع ميکنن

مقدار سنجی بر روی مقدار چرخه آستانه (Ct) بستگی دارد. تعداد چرخه زمانی که فلورسنت از پس زمینه فراتر می رود. مقادیر پایین تر Ct نشان دهنده غلظت اولیه DNA بالاتر است. روش های تجزیه و تحلیل شامل:

• کمی کردن نسبی:مقایسه بیان ژن هدف بین نمونه ها با استفاده از ژن های مرجع برای عادی سازی
• مقدار مطلق:تعیین تعداد دقیق کپی های DNA با استفاده از منحنی های استاندارد از غلظت های شناخته شده

• تجزیه و تحلیل بیان ژن:اندازه گیری سطح mRNA
• تشخیص عوامل بیماری زا:اندازه گیری بار ویروسی/باکتری
• توسعه داروها:ارزیابی اثرات دارویی بر بیان ژن
• تحقیقات سرطان:تشخیص نشانگرهای زیستی تومور

PCR نسخه معکوس (RT-PCR) RNA را به DNA تکمیلی (cDNA) برای تقویت بعدی تبدیل می کند و تشخیص RNA را امکان پذیر می کند. دو فرمت وجود دارد:

• RT-PCR یک مرحله ای:ترکیب ترانسکرپشن معکوس و PCR در یک لوله
• RT-PCR دو مرحله ای:واکنش ها را به ترتیب انجام می دهد

ترکیب RT-PCR با qPCR RT-qPCR را ایجاد می کند که استاندارد طلایی برای کمی کردن mRNA در مطالعات بیان ژن است.

تجزیه و تحلیل PCR شامل تجسم ساده ژل از نوارهای DNA است که نشان دهنده حضور / عدم وجود و فراوانی نسبی از طریق شدت نوار است. با این حال، این رویکرد دقت کمی محدود را ارائه می دهد.

تجزیه و تحلیل qPCR مقداری پیچیده از طریق مقادیر Ct را فراهم می کند که نیاز به:

• اصلاح خط ابتدایی برای توجه به فلورسنت پس زمینه
• تنظیم محدوده دقیق برای تعیین دقیق Ct
• تجزیه و تحلیل منحنی ذوب برای تأیید خاصیت تقویت

برای کمی کردن نسبی، انتخاب مناسب ژن مرجع و عادی سازی بسیار مهم است، در حالی که کمی کردن مطلق مستلزم منحنی های استاندارد با کیفیت بالا است.

انتخاب بین PCR و qPCR به اهداف تحقیق بستگی دارد:

• بیان ژن:RT-qPCR
• تشخیص عوامل بیماری زا:qPCR
• کلون کردن ژن:PCR
• توالی DNA:PCR

PCR برای تشخیص حضور/غياب کافی است، در حالی که qPCR برای الزامات کمی دقیق ضروری است.