وبلاگ در باره اصول کلیدی و رفع مشکل برای کیت استخراج اسید نوکلئیک

استخراج اسید نوکلئونیک به عنوان سنگ بنای آزمایشات زیست شناسی مولکولی عمل می کند.بسیاری از محققان متوجه می شوند که خود را گیج می کنند، به خصوص در هنگام رفع مشکلات نتایج غیر منتظره. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable، فرآیند کارآمد.

اکثر کیت های استخراج اسید نوکلئیک تجاری از تکنولوژی ستون چرخش غشای سیلیس استفاده می کنند، با پنج مرحله مهم: لیز سلول، اتصال اسید نوکلئیک، شستن و تصفیه، خشک کردن،و الوشن نهایی. هر مرحله بر روی مرحله قبل بنا می شود، به این معنی که هر اشتباه می تواند کل استخراج را به خطر بیندازد.

لیز سلول موثر اولین گام حیاتی است. فرمول های بافر لیز بسته به اینکه آیا DNA یا RNA استخراج می شود، متفاوت است.اما به طور معمول حاوی غلظت بالای نمک های کائوتروپ است که به اهداف دوگانه خدمت می کنند.:

• دناتوراسیون پروتئین:این نمک ها پیوندهای هیدروژنی، نیروهای ون در والز و تعاملات هیدروفوبی را مختل می کنند و پروتئین ها را (از جمله نوکلئاز ها) برای جلوگیری از تخریب اسید نوکلئیک بی ثبات می کنند.
• برای تسهیل پیوند سیلیس:چوتروپ ها مولکول های آب را از اسید نوکلئیک جابجا می کنند و شرایط مطلوبی را برای انتقال به غشا های سیلیکون ایجاد می کنند.

نمک های کائوتروپیک رایج شامل هیدروکلوراید گوانیدین ، تیوسیانات گوانیدین ، اوره و پرکلورات لیتیوم است. مواد شوینده اغلب برای کمک به حلال شدن پروتئین و لیز سلول اضافه می شوند.بسته به نوع نمونهپروتئیناز K به طور موثر پروتئین ها را در داروهای اسید نوکلئیک هضم می کند، به ویژه در شرایط دناتور کردن. لیزوزیم یک آنزیم رایج دیگر است.اگرچه فعالیت آن در شرایط دناتور شدن کاهش می یابد..

استخراج پلاسمید به طور قابل توجهی با جداسازی RNA یا DNA ژنومی متفاوت است. تمایز حیاتی در اولین جدایی DNA پلاسمید از DNA ژنومی است.اضافه کردن نمک های کائوتروپیک بلافاصله باعث آزاد شدن همه انواع DNA بدون تمایز می شودبنابراین، پروتکل های پلاسمید معمولاً بعد از لیز اولیه سلول، کائوتروپ ها را معرفی می کنند.

علاوه بر لیز، نمک های کائوتروپیک اتصال اسید نوکلئیک را به ستون های سیلیس تسهیل می کنند. اتانول (یا گاهی اوقات ایزوپروپانول) این اتصال را افزایش می دهد.ستون های سیلیکونی حاوی رزین هستند که بسته به غلظت نمک و عوامل دیگر به طور انتخابی به DNA یا RNA متصل می شونداسیدهای نوکلئیکی حاصل از آن دارای طهارت بالایی هستند که برای شبیه سازی، توالی طولانی و سایر کاربردهای دیگر مناسب هستند.

غلظت اتانول بسیار مهم است. اتانول بیش از حد مواد فرسوده و مولکول های کوچک را به وجود می آورد، که بر قراءات جذب A260 تاثیر می گذارد.اتانول ناکافی ممکن است از حذف نمک از غشا جلوگیری کندحجم اتانول ارائه شده توسط کیت از قبل بهینه شده است، اما اگر به نظر می رسد DNA تخریب شده به خواندن A260 تغییر می دهد، بهینه سازی مجدد غلظت اتانول ممکن است کمک کند.محلول های جریان قابل ذخیره برای بارندگی برای بازیابی اسیدهای نوکلئیک از دست رفتههنگامی که مواد شوینده حاوی SDS در لیز استفاده می شود، NaCl به عنوان یک توده کننده موثر که از آلودگی مواد شوینده جلوگیری می کند، عمل می کند.

پس از سانتریفیوژ کردن لیزات از طریق غشای سیلیس، اسیدهای نوکلئیک هدف به ستون ها متصل می شوند در حالی که پروتئین ها و پلی ساکاریدها در جریان باقی می مانند.غشای باقیمانده پروتئین ها و نمک ها را حفظ می کند.نمونه های گیاهی ممکن است پلی ساکاریدها و رنگدانه ها را ترک کنند؛ نمونه های خونی اغلب باعث تغییر رنگ قهوه ای یا زرد می شوند. مراحل شستشوی این آلاینده ها را از بین می برد.

معمولاً دو بار شستشو می شود، اگرچه تعداد دقیق آن ها به نوع نمونه بستگی دارد. شستشو اول معمولاً حاوی غلظت های پایین chaotrope برای حذف پروتئین ها و رنگدانهای باقیمانده است.پس از آن با اتانول شسته می شود تا نمک ها حذف شوند.نمونه هایی که در ابتدا پروتئین کمتری دارند (به عنوان مثال، آماده سازی پلاسمید یا تصفیه محصول PCR) ممکن است فقط نیاز به شستن اتانول داشته باشند. حذف کامل chaotrope برای بهره وری و خلوص بالا ضروری است.برخی از کیت ها توصیه می کنند که دو بار با اتانول شسته شود.نمک های باقیمانده مانع از انزوا می شوند، تولیدات را کاهش می دهند و مقادیر A230 را افزایش می دهند که نسبت A260/230 را کاهش می دهد.

اکثر پروتکل ها شامل سانتریفیوژ پس از شستشو برای خشک کردن اتانول باقیمانده از ستون ها است. این مرحله برای الوهات های تمیز بسیار مهم است.اضافه کردن 10 mM Tris بافر یا آب سپس اسیدهای نوکلئیکی را برای آزاد شدن غشا هیدراته می کنداتانول باقیمانده مانع از ريهدراتسيون کامل و الوسيون ميشهنشانه های آشکار عبارتند از نمونه هایی که نمی توانند در چاه های ژل آگاروز قرار بگیرند (حتی با وجود رنگ بارگذاری) یا عدم توانایی منجمد شدن در -20 °C.

مرحله نهایی استخراج DNA، اسیدهای نوکلئیک خالص را از سیلیس آزاد می کند. برای DNA، 10 mM Tris در pH 8-9 استاندارد است.DNA در pH کم قلیایی پایدارتر باقی می ماند و سریعتر در آب از آب حل می شود. حتی گرده افشانی های DNA نیز رفتار مشابهی دارند. آب به طور معمول pH پایین تری (4-5) را نشان می دهد و وزن مولکولی DNA بالا ممکن است به سرعت به طور کامل هیدراته نشود. برای حداکثر بازیابی DNA،اجازه دهید بافر روی غشا برای چند دقیقه قبل از سانتریفیوژ قرار گیردبرای کاربردهایی که نیاز به DNA سالم با وزن مولکولی بالا دارند (به عنوان مثال، توالی طولانی خواندن) ، بافرهای الوشن بهینه هستند. RNA pH کم اسیدی را تحمل می کند و به راحتی در آب حل می شود.که آب را به عنوان رقیق کننده مورد علاقه قرار می دهد.

حتی با پیروی از پروتکل های استاندارد، استخراج می تواند با مشکلات مختلفی روبرو شود:

• بازده کم:اغلب ناشی از لیز نامکمل یا شرایط نامناسب اتصال است. همیشه از اتانول بی آب تازه و با کیفیت بالا برای رقیق کردن بافر و مراحل اتصال استفاده کنید.اتانول ضعیف یا قدیمی ممکن است رطوبت را جذب کندبه یاد داشته باشید که آب کش های شستشو که به درستی آماده نشده اند می توانند اسیدهای نوکلئیک استخراج شده را از بین ببرند!
• خلوص کم:آلودگی پروتئین اغلب ناشی از مواد اولیه بیش از حد است که خطر انحلال ناقص را افزایش می دهد. نسبت های A260/230 پایین به طور معمول نشان دهنده نمک های باقیمانده یا شستن ناکافی است.استفاده از اتانول با بالاترین کیفیت برای پاک کننده های شستن، و اگر مشکلات ادامه یابد، مراحل شستشو اضافی را اضافه کنید.
• مواد آلوده کننده:نمونه های محیطی به طور خاص در برابر مواد هومیک که با DNA پاک می شوند و در برابر حذف ستون سیلیکاس مقاومت می کنند، حساس هستند.تکنیک های تخصصی می توانند پروتئین های مداخله کننده و humics را قبل از اتصال ستون حذف کنند.
• تخریب:RNA با خطرات بیشتر تخریب روبرو است، به طور معمول از ذخیره سازی نمونه نامناسب یا لیز غیر کارآمد (با فرض استفاده از آب بدون RNase).تخریب برای برنامه های PCR اهمیت کمتری دارد اما برای توالی طولانی خواندن که نیاز به DNA سالم با وزن مولکولی بالا دارد مهم می شود!
• تصفیه محصول PCR:در حالی که به طور دقیق استخراج DNA نیست، این مورد ارزش ذکر دارد. به طور معمول، 3-5 حجم محلول نمک در هر حجم واکنش PCR قبل از تصفیه ستون اسپین اضافه می شود.تصفیه های شکست خورده معمولاً ناشی از شکست PCR است.اما صرفه جویی در جریان عاقلانه است اگر باند های شفاف PCR به ستون ها متصل نشوند، احتمالاً برای بازیابی و پاکسازی مجدد در جریان باقی می مانند.

لیز نامکمل ممکن است به صورت حاصلات کم غیر منتظره، انحلال ناقص پروتئین یا نسبت A260/230 ضعیف ظاهر شود.این نشان می دهد که برخی از اجزای نمونه در طول استخراج به طور کامل لیز یا حل نشده اند.تمایز لیز نامکمل از آلودگی یا تخریب نیاز به تجزیه و تحلیل دقیق شرایط استخراج، از جمله ترکیب بافر لیز، پارامترهای انکوبیشن،و مواد مخرب بالقوهبه عنوان مثال، نسبت های ضعیف A260/230 ممکن است نشان دهنده نمک های باقی مانده پس از اتصال یا شستن ناکافی باشد نه لیز نامکمل.رسیدگی به لیزی نامکمل ممکن است نیاز به بهینه سازی اجزای بافر لیزی داشته باشد.، زمان انکوبیشن، یا ترکیب روش های لیز میکانیکی/انزیمی اضافی.

تکنیک های تخصصی هدف از حذف مواد هومیک و سایر مداخله کننده هایی است که ممکن است با اسیدهای نوکلئیک از نمونه های محیط پاک شوند.این موارد شامل بافرهای استخراج تخصصی حاوی عوامل کلر (e.مثل EDTA) برای اتصال و حذف انتخابی کتیون ها.روش های قبل از درمان مانند سانتریفیوژن یا فیلتراسیون می تواند به حذف ذرات بزرگتر از نمونه های محیطی قبل از استخراج اسید نوکلئیک کمک کند.، کاهش تداخل در طول مراحل اتصال.

نمونه های خاصی (به عنوان مثال بافت ها یا مواد غنی از چربی) چالش های خاصی را ارائه می دهند.نمونه های بافت اغلب نیاز به اختلال مکانیکی اضافی یا هضم آنزیم برای اطمینان از لیز کامل و آزاد شدن اسید نوکلئیک دارند.نمونه های غنی از چربی ممکن است تصفیه را پیچیده کند زیرا چربی ها می توانند با اتصال اسید نوکلئیک به ماتریس های ستون تداخل داشته باشند.بهینه سازی پروتکل های تصفیه، یا با استفاده از کیت های طراحی شده ویژه.

در ابتدا در 28 ژوئن 2010 منتشر شد. بررسی و دوباره در ماه مه 2021 و مارس 2024 منتشر شد.