راهنمای PCR روش های RTPCR و Qpcr توضیح داده شده است

آیا تا به حال در آزمایشگاه با اصطلاحات "PCR"، "RT-PCR" و "qPCR" گیج شده‌اید؟ نگران نباشید—این مقاله به وضوح تفاوت‌های بین این تکنیک‌ها را به زبان ساده توضیح می‌دهد و به شما کمک می‌کند تا تحقیقات خود را به طور موثرتری هدایت کنید.

PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، مانند یک "دستگاه فتوکپی" DNA عمل می‌کند. این تکنیک اساسی زیست‌شناسی مولکولی که توسط کاری مولیس اختراع شد، توالی‌های DNA هدف را در شرایط آزمایشگاهی به سرعت تکثیر می‌کند و میلیون‌ها تا میلیاردها کپی را در عرض چند ساعت تولید می‌کند. PCR برای کلون‌سازی ژن، توالی‌یابی DNA، تشخیص بیماری و بسیاری از کاربردهای دیگر ضروری است.

فرآیند PCR از سه مرحله تکراری تشکیل شده است که امکان تکثیر نمایی DNA را فراهم می‌کند:

1. واپاشی: دمای بالا (94-98 درجه سانتی‌گراد) DNA دو رشته‌ای را به رشته‌های تک‌رشته‌ای جدا می‌کند.
2. اتصال: کاهش دما (50-65 درجه سانتی‌گراد) به آغازگرها اجازه می‌دهد تا به توالی‌های هدف مکمل متصل شوند.
3. افزایش: پلیمراز DNA (معمولاً پلیمراز Taq) رشته‌های مکمل جدید را در دمای 72 درجه سانتی‌گراد سنتز می‌کند.

پس از 25-40 چرخه، DNA تکثیر شده را می‌توان با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز مشاهده کرد.

PCR کمی (qPCR) یا PCR در زمان واقعی بر اساس PCR متعارف ساخته شده است و با گنجاندن تشخیص فلورسانس برای نظارت بر تکثیر در زمان واقعی، مقدار اولیه قالب DNA را نیز اندازه‌گیری می‌کند.

دو روش اصلی تشخیص فلورسانس وجود دارد:

• رنگ‌های متصل‌شونده به DNA (به عنوان مثال، SYBR Green): مقرون به صرفه اما غیر اختصاصی، اتصال به تمام DNA دو رشته‌ای.
• پروب‌های فلورسنت: هدفمند اما گران‌تر، نیازمند پروب‌های سفارشی طراحی شده.

شاخص اصلی qPCR مقدار Ct (چرخه آستانه) است—شماره چرخه‌ای که در آن فلورسانس از یک آستانه تعریف شده فراتر می‌رود. مقادیر Ct پایین‌تر نشان‌دهنده غلظت‌های اولیه قالب بالاتر است.

کاربردها شامل:

• تجزیه و تحلیل بیان ژن
• تشخیص پاتوژن
• غربالگری دارو
• تحقیقات سرطان

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR) ابتدا RNA را با استفاده از رونویسی معکوس به DNA مکمل (cDNA) تبدیل می‌کند، سپس cDNA را از طریق PCR استاندارد تکثیر می‌کند. این امر امکان تجزیه و تحلیل RNA را فراهم می‌کند، از جمله:

• مطالعات بیان ژن
• تشخیص ویروس RNA (به عنوان مثال، HIV، آنفولانزا)
• تحقیقات ساختار/عملکرد RNA

RT-PCR کمی در زمان واقعی، رونویسی معکوس را با qPCR ترکیب می‌کند تا سطوح بیان RNA را اندازه‌گیری کند. این روش استاندارد طلایی به طور گسترده برای موارد زیر استفاده می‌شود:

• اندازه‌گیری دقیق بیان ژن
• اندازه‌گیری microRNA
• مطالعات RNA غیر کدکننده بلند

qPCR نیازمند آغازگرها و پروب‌های با دقت طراحی شده برای اطمینان از اختصاصی بودن است. عدم تطابق می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود.

آنزیم‌های مختلف (به عنوان مثال، AMV، M-MLV) در پایداری حرارتی و کارایی متفاوت هستند که بر بازده cDNA تأثیر می‌گذارد.

تکثیر غیر اختصاصی را می‌توان از طریق دمای اتصال بهینه و پلیمرازهای با وفاداری بالا به حداقل رساند.

درک تمایزات این تکنیک‌های مولکولی، محققان را قادر می‌سازد تا روش‌های مناسب را برای نیازهای آزمایشگاهی خاص خود انتخاب کنند و از نتایج دقیق و قابل اعتماد اطمینان حاصل کنند.