وبلاگ در باره پیشرفت در تکنیک های تجزیه و تحلیل RNA برای مطالعات بیان ژن

در تعقیب اکتشافات علمی، محققان اغلب در به دست آوردن داده‌های بیان ژن قابل اعتماد با چالش‌هایی مواجه می‌شوند که اغلب با پیچیدگی‌های استخراج RNA، کارایی سنتز cDNA و دقت qPCR دست و پنجه نرم می‌کنند. این مقاله یک گردش کار آزمایشی دقیق را ارائه می‌کند که برای ارائه تجزیه و تحلیل بیان ژن دقیق طراحی شده است.

سنگ بنای تجزیه و تحلیل دقیق در رسیدگی دقیق نمونه نهفته است. پایداری RNA برای کاربردهای پایین دستی حیاتی است و نیاز به پروتکل‌های حفاظتی دقیق دارد:

• پروتکل انجماد فلش:گلوله های سلولی بلافاصله پس از جمع آوری تحت غوطه وری در یخ خشک قرار می گیرند، به طور موثری از فعالیت RNase جلوگیری می کنند و یکپارچگی RNA را از طریق انجماد سریع حفظ می کنند.
• سیستم تصفیه خودکار:پلت فرم Maxwell® RSC 48 با کیت سلولی ساده RNA (Promega) روش‌های دستی را با اتوماسیون مبتنی بر دانه‌های مغناطیسی جایگزین می‌کند و از استخراج RNA ثابت و با خلوص بالا و در عین حال به حداقل رساندن خطرات آلودگی را تضمین می‌کند.
• اعتبارسنجی اسپکتروفتومتری:RNA استخراج شده تحت ارزیابی کیفیت دقیق از طریق ابزار دقیق NanoDrop، با نسبت های A260/A280 و A260/A230 به عنوان شاخص خلوص حیاتی برای آلودگی پروتئین و ترکیبات آلی عمل می کند.

انتقال از RNA ناپایدار به cDNA پایدار نشان دهنده یک مرحله مهم در تجزیه و تحلیل بیان ژن است:

• رونویسی معکوس با ظرفیت بالا:کیت رونویسی معکوس cDNA با ظرفیت بالا (Thermo Fisher Scientific) تا 1 میکروگرم ورودی RNA را پردازش می کند و حساسیت را در سطوح مختلف فراوانی رونوشت حفظ می کند.
• پارامترهای واکنش بهینه:شرایط کالیبره شده با دقت از جمله غلظت dNTP، انتخاب پرایمر (هگزامرهای تصادفی یا الیگو(dT))، و پارامترهای چرخه حرارتی، بازده cDNA را به حداکثر می‌رسانند در حالی که آثار تخریب را به حداقل می‌رسانند.

شیمی TaqMan® استاندارد طلایی را برای تعیین کمیت بیان ژن از طریق مکانیسم دو ویژگی خود فراهم می کند:

• تشخیص توالی خاص:سنجش‌های بیان ژن از پیش تایید شده TaqMan® پرایمرهای خاص هدف را با پروب‌های فلوروژنیک ترکیب می‌کنند و امکان تعیین کمیت در زمان واقعی را از طریق فعالیت نوکلئاز 5 در طی تقویت PCR فراهم می‌کنند.
• سازگاری واکنش:TaqMan® Master Mix شرایط بافر و فعالیت آنزیمی بهینه‌شده را فراهم می‌کند و از سینتیک‌های تقویت‌پذیر تکرارپذیر در تکرارهای فنی اطمینان می‌دهد.
• کنترل های تجربی:هر تجزیه و تحلیل شامل کنترل‌های رونویسی معکوس منفی (-RT) برای تشخیص آلودگی DNA ژنومی و نرمال‌سازی به ژن‌های مرجع درون‌زا (به عنوان مثال، GAPDH) برای توضیح تنوع فنی.
• چارچوب کمی:روش ΔΔCt تغییرات بیان نسبی را محاسبه می کند، با ابزار دقیق QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems) که تشخیص فلورسانس دقیق را برای تعیین ارزش Ct قابل اعتماد ارائه می دهد.

مقادیر بیان نهایی نشان دهنده تغییرات برابری نرمال شده نسبت به شرایط کنترل است که امکان تعیین کمیت دقیق تنظیم رونویسی را فراهم می کند. این رویکرد استاندارد، مقایسه‌های آزمایشی را تسهیل می‌کند و مجموعه داده‌های قوی را برای بررسی عملکرد ژن، تجزیه و تحلیل مسیر و مکانیسم‌های بیماری فراهم می‌کند.

گردش کار ارائه شده از تثبیت RNA از طریق PCR کمی نشان دهنده یک خط لوله بهینه برای مطالعات بیان ژن، ترکیبی از دقت فنی با دقت تحلیلی برای حمایت از کشف علمی تکرارپذیر است.