اصول تفسیر آزمایش RTPCR و خطر کووید-۱۹

با توجه به اینکه همه‌گیری کووید-۱۹ همچنان چالش‌های جهانی را به همراه دارد، آزمایش RT-PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونوشت معکوس) همچنان استاندارد طلایی برای تشخیص عفونت SARS-CoV-2 است. اما چه تعداد واقعاً اصول علمی پشت این ابزار تشخیصی حیاتی را درک می‌کنند؟ این مقاله توضیحی عمیق و در عین حال قابل دسترس از آزمایش RT-PCR ارائه می‌دهد و به متخصصان پزشکی و عموم مردم کمک می‌کند تا این فناوری حیاتی را بهتر درک کنند.

RT-PCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونوشت معکوس در زمان واقعی، یک تکنیک زیست‌شناسی مولکولی بسیار حساس و سریع است که برای تشخیص مواد ژنتیکی خاص در نمونه‌ها استفاده می‌شود. این مواد ژنتیکی می‌توانند از انسان، باکتری‌ها یا ویروس‌هایی مانند SARS-CoV-2 منشا بگیرند.

فناوری اصلی پشت RT-PCR، PCR است که توسط کاری بی. مولیس در دهه ۱۹۸۰ اختراع شد (و جایزه نوبل را برای او به ارمغان آورد). PCR اهداف DNA خاص را تکثیر و تشخیص می‌دهد. پیشرفت‌های بعدی امکان تجسم و اندازه‌گیری «در زمان واقعی» اهداف DNA را در طول تکثیر فراهم کرد. در PCR در زمان واقعی، شدت فلورسانس از پروب‌های تخصصی با مقدار DNA تکثیر شده همبستگی دارد.

با این حال، PCR استاندارد فقط DNA را تشخیص می‌دهد. از آنجایی که SARS-CoV-2 حاوی مواد ژنتیکی RNA است، این آزمایش به آنزیم رونوشت معکوس نیاز دارد تا RNA را به DNA مکمل (cDNA) تبدیل کند. این مرحله رونوشت معکوس، همراه با PCR در زمان واقعی، RT-PCR را به ابزاری قدرتمند برای تشخیص ویروس‌های RNA مانند SARS-CoV-2 تبدیل می‌کند.

درک RT-PCR نیازمند دانش اولیه از مواد ژنتیکی است—راهنمای دستورالعمل که رفتار سلولی و ویروسی، بقا و تولید مثل را کنترل می‌کند. مواد ژنتیکی به دو شکل اصلی وجود دارند: DNA (اسید دئوکسی ریبونوکلئیک) و RNA (اسید ریبونوکلئیک). DNA دارای ساختار دو رشته‌ای است در حالی که RNA تک رشته‌ای است. برای اهداف تشخیصی، پایداری بیشتر DNA آن را برای آزمایش بیماری‌های عفونی ترجیح می‌دهد. قابل توجه است که SARS-CoV-2 فقط حاوی RNA است.

همه ویروس‌ها ویژگی مشترک وابستگی به سلول‌های میزبان برای بقا و تکثیر را دارند. SARS-CoV-2، مانند سایر ویروس‌ها، به سلول‌های سالم حمله می‌کند تا تکثیر شود. هنگامی که عفونت رخ می‌دهد، ویروس RNA خود را آزاد می‌کند و ماشین‌آلات سلولی را برای تکثیر به کار می‌گیرد. تا زمانی که مواد ژنتیکی ویروسی در سلول‌ها باقی بماند، RT-PCR می‌تواند عفونت SARS-CoV-2 را تشخیص دهد.

متخصصان مراقبت‌های بهداشتی آموزش‌دیده نمونه‌های سواب نازوفارنکس را جمع‌آوری می‌کنند که سپس در لوله‌های استریل حاوی محیط انتقال ویروسی قرار می‌گیرند تا یکپارچگی ویروسی حفظ شود.

در آزمایشگاه، محققان RNA را با استفاده از کیت‌های خالص‌سازی تجاری استخراج می‌کنند. سپس نمونه RNA به مخلوط واکنشی اضافه می‌شود که حاوی تمام اجزای لازم برای آزمایش، از جمله DNA پلیمراز، رونوشت معکوس، بلوک‌های سازنده DNA و پروب‌ها و آغازگرهای فلورسنت خاص SARS-CoV-2 است.

از آنجایی که PCR فقط با الگوهای DNA کار می‌کند، رونوشت معکوس تمام RNA موجود در نمونه (از جمله RNA انسانی، باکتریایی، سایر کروناویروس‌ها و احتمالاً RNA SARS-CoV-2) را به cDNA تبدیل می‌کند.

این فرآیند شامل سه مرحله تکراری است:

• واسرشت‌سازی: گرم کردن DNA تا >90 درجه سانتی‌گراد به مدت حدود ۱۰ دقیقه، DNA دو رشته‌ای را به رشته‌های منفرد جدا می‌کند.
• اتصال آغازگر: قطعات DNA کوتاه (آغازگرها) که به‌طور ویژه طراحی شده‌اند، در دماهای پایین‌تر به اهداف cDNA خاص SARS-CoV-2 متصل می‌شوند. اهداف ژنی رایج کووید-۱۹ شامل RNA پلیمراز وابسته به RNA (RdRP)، ORF1ab، ژن S (پروتئین اسپایک)، ژن N (نوکلئوکپسید) و ژن E (پوشش) است.
• افزایش طول: DNA پلیمراز از آغازگرها به عنوان نقاط شروع برای ایجاد نسخه‌های یکسان از بخش‌های DNA هدف استفاده می‌کند.

این فرآیند معمولاً ۴۰ بار تکرار می‌شود و DNA هدف را در هر چرخه دو برابر می‌کند. پروب‌های فلورسنت به پایین‌دست آغازگرها متصل می‌شوند و با هر تکثیر DNA سیگنال‌های قابل تشخیص را آزاد می‌کنند. افزایش DNA هدف با افزایش شدت فلورسانس همبستگی دارد.

داده‌های فلورسانس یک مقدار «آستانه چرخه» (Ct) تولید می‌کند—تعداد چرخه‌های مورد نیاز برای اینکه سیگنال از سطوح پس‌زمینه فراتر رود. نمونه‌هایی با DNA هدف بیشتر سریع‌تر تکثیر می‌شوند و به چرخه‌های کمتری (مقادیر Ct کمتر) نیاز دارند. برعکس، DNA هدف کمیاب به چرخه‌های بیشتری (مقادیر Ct بالاتر) نیاز دارد.

مقادیر Ct اطلاعات حیاتی در مورد بار ویروسی ارائه می‌دهند. مقادیر Ct کمتر نشان‌دهنده مقادیر ژنوم ویروسی بالاتر است، در حالی که مقادیر بالاتر مقادیر کمتری را نشان می‌دهند. ارائه‌دهندگان مراقبت‌های بهداشتی مقادیر Ct را با علائم بالینی و سابقه ترکیب می‌کنند تا مرحله بیماری را ارزیابی کنند. مقادیر Ct متوالی از آزمایش‌های تکراری به نظارت بر پیشرفت بیماری و پیش‌بینی بهبودی کمک می‌کند. ردیاب‌های تماس نیز از مقادیر Ct برای اولویت‌بندی بیماران با بالاترین بار ویروسی (و در نتیجه بیشترین خطر انتقال) استفاده می‌کنند.

• بار ویروسی: مقادیر Ct با بار ویروسی رابطه معکوس دارند—Ct کمتر به معنای وجود ویروس بیشتر است.
• مرحله بیماری: عفونت اولیه معمولاً بارهای ویروسی بالایی (Ct کم) را نشان می‌دهد، در حالی که مراحل بعدی بارهای در حال کاهش (Ct در حال افزایش) را نشان می‌دهد زیرا سیستم ایمنی عفونت را پاک می‌کند.
• خطر انتقال: بارهای ویروسی بالاتر (مقادیر Ct کمتر) نشان‌دهنده پتانسیل انتقال بیشتر است که اقدامات ایزوله سخت‌گیرانه‌تری را تضمین می‌کند.

با وجود اینکه استاندارد طلایی تشخیصی کووید-۱۹ است، RT-PCR محدودیت‌هایی دارد:

• منفی کاذب: نمونه‌برداری نادرست، بارهای ویروسی کم یا آزمایش زودهنگام می‌تواند نتایج منفی را با وجود عفونت واقعی ایجاد کند.
• مثبت کاذب: نتایج مثبت نادر اما ممکن است بدون عفونت واقعی رخ دهد.
• چالش‌های استانداردسازی: آزمایشگاه‌ها و پلتفرم‌های مختلف ممکن است از آستانه‌های Ct متفاوتی استفاده کنند که مقایسه‌ها را پیچیده می‌کند.

آزمایش RT-PCR برای تشخیص کووید-۱۹ با تشخیص مواد ژنتیکی SARS-CoV-2 ضروری است. مقادیر Ct به عنوان شاخص‌های حیاتی بار ویروسی، پیشرفت بیماری و خطر انتقال عمل می‌کنند. با این حال، محدودیت‌های آزمایش مستلزم ترکیب نتایج با ارزیابی بالینی برای تشخیص و مدیریت دقیق است.