وبلاگ در باره دانشمندان تکنیک های Qpcr را برای تحلیل بیان ژن توسعه می دهند

تصور کنید که یک کلید را در دست دارید که به طور دقیق تغییرات بیان ژن را در سلول ها ردیابی می کند، پی سی آر کمی در زمان واقعی (qPCR) این ابزار قابل توجه است.این روش پیشرفته مولکولی نه تنها توالی های خاص DNA را تشخیص می دهد بلکه مقدار آن ها را نیز به دقت اندازه گیری می کند، انقلابی در تحقیقات ژنتیکی و تشخیص.

برخلاف PCR سنتی که نتایج پس از تقویت را تجزیه و تحلیل می کند، qPCR تکثیر DNA را در زمان واقعی از طریق سیگنال های فلورسنت نظارت می کند.این تمایز باعث می شود که qPCR که همچنین PCR کمی در زمان واقعی نیز نامیده می شود، یک ابزار قدرتمند برای تجزیه و تحلیل پویا باشد..

PCR نسخه معکوس (RT-PCR) هدف متفاوتی را دارد، هدف های RNA را با تبدیل آنها به cDNA تقویت می کند. در حالی که RT-PCR بر تجزیه و تحلیل RNA تمرکز دارد،qPCR در اندازه گيري زمان واقعي تخصص دارد.

روش SYBR Green بازتاب دهنده چرخه سه فاز PCR سنتی است اما شامل یک رنگ فلورسنت است که تمام DNA دو رشته ای را متصل می کند.این رنگ دار فلورسنت قابل اندازه گیری را متناسب با غلظت DNA تولید می کند..

در حالی که مقرون به صرفه است، عدم خاصیت SYBR Green نیاز به تجزیه و تحلیل منحنی ذوب برای تشخیص تقویت هدف از محصولات غیر خاص مانند دیمرهای اولیه دارد.

سیستم TaqMan از سنجه های اولیگونوکلوئوتید با گزارشگرهای فلورسنت و خاموش کننده ها استفاده می کند.این سنجه ها به طور خاص دنباله های هدف را متصل می کنند و فلورسنت را در هنگام شکستن توسط فعالیت 5'-3' اکسونوکلیس پلیمراز Taq در طول گسترش آزاد می کنند..

اگرچه گران تر است، TaqMan مزایای مهمی را ارائه می دهد:

• ويژگي افزوده:کاوشگرها فقط دنباله های هدف را متصل می کنند، سیگنال های غلط را از بین می برند
• ظرفیت چندگانه:تشخیص همزمان چندین هدف با استفاده از سنجه های برچسب گذاری شده متفاوت

نتایج qPCR به طور معمول به عنوان منحنی های تقویت کننده که فلورسنت را در برابر چرخه های حرارتی نشان می دهد، نمایش داده می شود.چرخه آستانه (Ct) (وقتی فلورسنت از پس زمینه فراتر می رود) نشان دهنده غلظت اولیه DNA است.، با مقادیر Ct پایین تر که نشان دهنده مقادیر اولیه بالاتر است.

تلاش های استاندارد سازی از طریق دستورالعمل های MIQE (حداقل اطلاعات برای آزمایشات PCR کمی در زمان واقعی) با اجبار گزارش پروتکل جامع، بازتولید تجربی را تضمین می کند.

قبل از تفسیر داده ها، آزمایش های qPCR نیاز به تأیید:

1. کارایی واکنش:در حالت ایده آل 90-110٪ محاسبه شده از طریق تجزیه و تحلیل شیب منحنی استاندارد
2. مشخصات خاص:تایید شده از طریق تجزیه و تحلیل منحنی ذوب با شناسایی قله های تک تقویت

تعداد دقیق کپی های هدف را با مقایسه مقادیر Ct نمونه با یک منحنی استاندارد غلظت شناخته شده تعیین می کند که برای برنامه هایی مانند آزمایش بار ویروسی حیاتی است.

مقایسه بیان ژن بین نمونه ها با استفاده از ژن های مرجع. روش ΔΔCt (برای واکنش های 95-105٪ کارایی) یا روش Pfaffl (برای کارایی متغیر) تغییرات فولد بیان را محاسبه می کند.

این روش ها محققان را قادر می سازد تا تغییرات ژنتیکی را با دقت اندازه گیری کنند و زمینه های تحقیقاتی از سرطان تا نظارت بر بیماری های عفونی را پیشرفت دهند.